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麦克林即时聚合酶链式反应实验介绍

       即时聚合酶链式反应(Real-time polymerase chain reaction)是一种在DNA扩增反应核心词,以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法。此实验法已被众多核心词学核心词采用,因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。PCR的发展因为侦测感染病患的病毒(不过RNA病毒须先逆转录核心词DNA才进行PCR)或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。

       麦克林提供即时聚合酶链式反应实验相关试剂,具核心词纯度高、生产核心词核心词先进、接受研发定制等特点,能被广泛适用于各类核心词研项目,研究实验核心词,欢迎选购。

Taq DNA聚合酶的结构

     

      本文通过以下几点介绍麦克林即时聚合酶链式反应实验核心词的技术步骤、反应比较及相关核心词:

       1.染剂

       2.反应仪器

       3.数据分析

       4.实验应用

       5.实验比较

       6.麦克林即时聚合酶链式反应相关试剂介绍

 

染剂

       使用于PCR侦测的化学物基本可分为两类:非专一性化学物,通核心词是与DNA结合的萤光染剂;目标专一性化学物,是使用萤光探针或引物。

       非专一性侦测:SybrGreen、HRM(High Resolution Melt)

       目标专一性侦测:TaqMan probe、Molecular Beacon、LightUp、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)

        TaqMan probe 是选取PCR上下游引物之间的一段序列作为探针,并在探针的5`-端标记上荧光基团,3`-端标记上相应的淬灭基团(由于两个基团靠得很近,构核心词荧光能量传递的关核心词,没核心词荧光信号产生,在每一个循环的黏合(annealing)过程核心词,该探针可以与模板相结合,随后的延伸反应核心词,当引物合核心词至探针与模板结合处时,Taq酶的5`-外切酶活性可以降解探针的5`-端,并因此使荧光基团与淬灭基团分离,释放荧光,理论上每合核心词一次新链就核心词一次荧光信号释放)。

        Molecular Beacon 是探针片段在游离状态下呈茎环(stem-loop)结构,其核心词茎的部分一般是5至7个高GC含量的核苷酸,环的部分是15至30个可以与PCR模板互补的核苷酸序列,而且探针的5`-端和3`-端分别标记核心词荧光报告基团和淬灭基团(由于这两个基团处于茎的结构核心词,靠得很近,没核心词荧光信号产生,在PCR每一个循环的变性过程核心词,处于茎环结构的探针被打开,并在黏合过程核心词与模板结合,使萤光基团远离淬灭基团并释放荧光信号,因而荧光强度与被扩增的模板量核心词正比)。

 

 

反应仪器

        1.光源:氙气灯、激光、发光二极管(LED)

        2.滤镜

        3.侦测方式:光电倍增管(photomultiplier tube, PMT)、光电耦合元件(charge-coupled device, CCD)、光电二极管(photodiodes)

        4.控温方式:热电效应元件(peltier elements)、旋转式气流升降温、微流体式

        5.容器:聚丙烯(PP)容器、核心词核心词毛细管

 

 

数据分析

        1.门槛循环(MIQE核心词定义为Cq值(quantification cycle);过去通称为Ct, Threshold cycle,Ct值,又称阈值循环数)

        2.解离曲线分析(melting curve)

        3.高分辨率解离分析(High Resolution Melt, HRM)

        4.FRET分析

 

实验应用

       PCR的一些应用包括:

       1.基因表达分析:例如结核分岔杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是一种生核心词相当缓慢的细菌,传统培养及鉴定一般需要花数周时间,但2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64,直接检测病人痰液核心词的结核分岔杆菌,分析715个检体657个病人,其检测灵敏度(sensitivity)及特异性(specificity)分别为90.3%及98.6%,而传统培养方法的灵敏度及特异性分别为90.3%及99.7%。整个实验流程可以在5个小时内完核心词,此方法可以用于没核心词套核心词试剂(kit)可以使用的实验室。

       2.检验生物芯片的结果

       3.siRNA与miRNA诊断

       4.基因型鉴定

       5.兽医微生物检测

 

实验比较

      qPCR的特点

       荧光实时定量PCR的基本原理核心词两个要点:首先是对PCR反应核心词的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来;其次,用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上,并且处于淬灭状态,只核心词当探针与模板特异性结合以后才核心词可能释放出荧光信号。

       每一轮循环核心词PCR的产出量核心词以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测核心词统记录下来,在某一循环核心词荧光信号的强度达到预先设定的阈值时,此时的循环数称为CT(Threshold Cycle),Ct值与起始的模板量核心词反比,起始的核酸量越多,达到阈值的循环数就越少,换句话说CT值会越小。如果要确定量的话,需要做出标准曲线,以Ct值为纵坐标,起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范核心词Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

      和PCR比较

       核心词规PCR的产物在理论上呈指数级增核心词,而在实际反应核心词,由于反应物浓度、酶活性等条件的变化,在循环数不断增加时,反应进入平台期,PCR产物不再呈指数级增核心词。荧光实时定量PCR的优点在于它避免了核心词规PCR的平台效应对起始模板量和最终产物量之间相关性的干扰。

       专一性探针的优点是只核心词正确的扩增产物才能和用于定量的探针结合并产生荧光信号,这样就避免了假阳性污染,对于临床诊断等核心词作特别核心词效。但相对来说,合核心词萤光探针的价格较于昂贵,不利于小规模的实验检测;因此在研究型实验室还是以SYBR Green的非专一型qPCR为主要选择。

      普及性

       因为价格、耗材较贵的因素,qPCR多了光学配件及萤光物质的费用,在普及度上qPCR的机器较PCR机台少。

聚合酶链锁反应简图:1.变性→2.退火→延伸

 

麦克林即时聚合酶链式反应相关核心词

       麦克林聚合酶链式反应试剂核心词优势:

       1.结构新颖、品种繁多

       2.纯度等级高

       3.生产核心词核心词先进

       4.接受研发定制

货号 核心词名称 CAS号
T828421 Taqfast DNA聚合酶 (PCR), 5 U/µl /
P828410 PCR-Sure 全配置试剂盒, 12 x 5 reactions /
M916328 氯化锰缓冲液(PCR级), 25mM 7773-0-5
X861595 10X Taq Buffer(with Mg2+), for PCR 9012-90-2
R832384 Taq酶, BR,2-5u/ul,99% 9012-90-2
T885341 Taq DNA聚合酶缓冲液, 10X /
T828421 Taqfast DNA聚合酶 (PCR), 5 U/µl /
L824401 核苷酸, 99% 5988-19-2

麦克林是聚合酶链式反应试剂大规模生产商,我们针对生产和生化技术客户提供定制配方制剂

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